Reza a lenda que beber do Santo Graal, usado por Jesus na Última Ceia, concede a vida eterna. Durante uma expedição de prospeção de ouro, foi descoberta uma lápide que documenta o Graal, e a possibilidade da sua existência atraiu uma multidão de pessoas obcecadas na sua busca. O Dr. Indiana Jones (interpretado por Harrison Ford) é um deles, e até o seu pai, o velho Jones (Sean Connery), ficou envolvido — mas desapareceu sem deixar rasto após entregar a Indiana as suas anotações sobre o Graal. Em solo veneziano, Jones encontra-se com a Dra. Schneider (Alison Doody), como combinado previamente. Seguindo as pistas, localizam um escudo sagrado numa biblioteca, mas começam a ser perseguidos sem motivo aparente pela Irmandade da Espada Cruzada. Após vários percalços, Jones finalmente reencontra o seu pai. Entretanto, a verdadeira identidade de Schneider como agente nazi é revelada, e as anotações são roubadas. O Santo Graal estava prestes a cair nas mãos dos nazis. Assim, pai e filho Jones unem-se para protagonizar uma emocionante aventura em defesa do Santo Graal!