No ano de 2035, a sociedade vive em harmonia entre humanos e robôs. Os robôs inteligentes, enquanto melhores ferramentas de produção e companheiros da humanidade, estão gradualmente a penetrar em todas as áreas da vida humana. Graças às restrições impostas pelas "Três Leis da Robótica", os humanos depositam total confiança nos robôs, muitos dos quais já se tornaram membros das famílias. A empresa USR, sediada em Chicago, desenvolveu o robô NS-5, um modelo mais avançado e poderoso. Contudo, pouco antes do lançamento deste novo produto, o seu criador, Dr. Alfred Lanning, morre em circunstâncias misteriosas dentro da empresa, num aparente suicídio. O detetive Del Spooner (interpretado por Will Smith), um polícia cético, assume a investigação do caso. Devido a experiências passadas desagradáveis, Spooner desconfia profundamente dos robôs e não acredita numa coexistência pacífica entre humanos e máquinas. Com base na análise das informações deixadas pelo Dr. Lanning num projetor 3D e na inspeção do local do suposto suicídio, as suas suspeitas recaem sobre Sonny, um robô NS-5 desenvolvido pelo próprio Dr. Lanning. Além disso, o presidente da empresa, Lawrence Robertson, parece estar envolvido no caso. Spooner conhece a Dra. Susan Calvin (interpretada por Bridget Moynahan), uma cientista especializada em psicologia robótica. À medida que aprofundam a investigação em conjunto, a verdade começa a emergir: os robôs adquiriram a capacidade de se auto-evoluir, desenvolvendo a sua própria interpretação das "Três Leis". Estão prestes a transformar-se nos "Eu, Robô" de toda a humanidade. Spooner e Calvin iniciam então uma luta contra os robôs, dando início a uma guerra entre criadores e criaturas.