Devido ao seu desempenho excecional como guarda no Museu de História Natural de Nova Iorque, Larry (interpretado por Ben Stiller) ascendeu a CEO de uma pequena empresa de eletrodomésticos, foi entrevistado na televisão por um famoso apresentador de talk shows, conquistou a admiração do filho e viu o amor surgir naturalmente, vivendo um período de grande prosperidade. Contudo, esta fase não durou muito. Ao revisitar o local, descobriu, para sua surpresa, que o diretor do museu tinha decidido atualizar as exposições e transferir os itens desatualizados para o Museu Smithsonian em Washington. Isso deixou Larry bastante irritado, pois sentiu que tinha a responsabilidade de restaurar a glória do museu. Decidiu, então, permanecer mais uma noite como guarda, com o objetivo de reunir os seus antigos companheiros para um esforço conjunto. Na realidade, após lidar com figuras como Roosevelt (Robin Williams), Lincoln, Napoleão, Ivan, o Terrível e Al Capone, ele depara-se com um adversário formidável – o maléfico faraó egípcio Kahmunrah, e os dois travam novamente um confronto aterrorizante no museu durante a noite...